окт 09 - апр 11
ИБК РАН (Институт, фундаментальные исследования.), Пущино
|
Младший научный сотрудник
На протяжении двух лет‚ занимался изучением селенового белка‚ глутатионпероксидазы 6. Ранее было показано‚ что глутатионпероксидаза 6 преимущественно локализуется в обонятельном эпителии‚ поэтому для получение рекомбинантного белка тотальная РНК была выделена именно из этого органа. После проведения реакции обратной транскрипции полученную кДНК использовали в качестве матрицы при амплификации открытой рамки считывания гена GPx6 с помощью ген-специфичных праймеров‚ несущих сайты рестрикции. Для выделения и аффинной очистки исследуемого белка субклонировали открытую рамку считывания гена Gpx6‚ не содержащую терминирующего кодона‚ в составе вектора pET23b (Novagen) по сайтам рестрикции EcoRI и XhoI. Полученной конструкцией трансформировали клетки E. сoli‚ Rosetta (DE3) (Novagen). При анализе экспрессии гена глутатион пероксидазы 6 нами было показано‚ что данный белок формирует тельца включения. Поэтому для получения Gpx6 в растворимом виде мы использовали мощный денатурирующий агент (8 М мочевину)‚ затем‚ белок был очищен на колонке с помощью аффинной хроматографии с Ni- NTA агарозой. Для определения внутриклеточной локализации Gpx6‚ субклонировали открытую рамку считывания его гена‚ не содержащую стоп-кодона в вектор pEGFP-N2 (Clontech) по сайтам рестрикции EcoRI и Apa1. Полученную конструкцию экспрессировали в клетках млекопитающих линии COS-7 . В результате был получен рекомбинантный белок‚ несущий на C-конце зеленый флуоресцентный белок (GFP). Дополнительно‚ для установления митохондриальной локализации GPx6‚ клетки‚ содержащие рекомбинантный белок‚ инкубировали с красителем митохондрий MitoTracker Deep Red 633 (Molecular Probe‚ USA). Локализацию GPx6 внутри клетки определяли с помощью конфокальной микроскопии‚ по результатам которой заключили‚ что исследуемый белок является цитоплазматическим и не локализуется в митохондриях.
|